PERBANDINGAN APLIKASI CAPILLARY ELECTROPHORESIS (CE) DENGAN PEMISAHAN YANG BERDASARKAN KROMATOGRAFI

PERBANDINGAN APLIKASI CAPILLARY ELECTROPHORESIS (CE) DENGAN PEMISAHAN YANG BERDASARKAN KROMATOGRAFI

CE secara umum memiliki kelebihan dibandingkan dengan teknik pemisahan yang berdasarkan kromatografi dalam analisis bahan organik, seperti efisiensi pemisahan yang tinggi, kecepatan analisis, fleksibilitas, ketelitian, kesederhanaan dan ekonomis dalam hal tenaga kerja, volume pelarut, pembuangan limbah, fase stasioner, memungkinkan jumlah sampel nanoliter, dan sedikit atau tidak diperlukan pretreatment sampel. Keunggulan dari teknik CE ini telah menjadi alternatif yang baik untuk kromatografi cair (LC) (Landers, 1997; Altria, 1996; Wätzig, 2003; Rajh, S.J., 2003).

CE memberikan resolusi yang lebih besar dari sejumlah besar fragmen peptida dan manfaat dalam analisis protein besar. Pemisahan protein dan DNA sudah dilakukan dengan menggunakan capillary gel electrophoresis, kuantifikasi lebih mudah dan lebih akurat (Altria, 1996). Untuk analisis sampel peptida selektivitas dan resolusi CE juga lebih baik dibandingkan dengan LC. Selain itu waktu analisis CE-MS lebih cepat dari LC-MS. Namun sensitivitas CE-MS lebih rendah bila dibandingkan dengan LC-MS (Serwe, 2000) dan RP-HPLC-MS untuk analisis protein matriks (Miksik, 2008)

Berdasarkan efisiensi pemisahan, selektivitas tinggi dan biaya yang lebih rendah, CE merupakan teknik yang lebih baik dalam hal quality control bidang farmasi dibandingkan dengan HPLC. Namun, ketepatan dalam kedua teknik adalah sama (Wätzig, 2003). Selama beberapa tahun terakhir, telah ditunjukkan bahwa CE adalah teknik yang sangat baik untuk resolusi dan kuantisasi enantiomer. Keuntungan utama dari teknik ini adalah efisiensi tinggi, waktu analisis cepat dan kemungkinan menggunakan selektor baru (Altria, 1996).

Beberapa sampel yang mengandung komponen matriks kompleks (sampel plasma, larutan polimer, ekstrak tanaman, dll) dapat langsung diinjeksikan tanpa pra-treatment lebih lanjut. Kapiler CE dapat dengan mudah dibersihkan dan diganti, dan karena itu, kolom CE lebih murah dibandingkan dengan kolom GC atau HPLC (Wätzig, 2003).  Asam klorida 2M terbukti sebagai reagen pembilas dapat diandalkan untuk menghilangkan protein yang teradsorpsi pada lapisan kapiler linear poliakrilamida. Asam fosfat 85% (m/m) bahkan lebih efektif untuk sampel protein khusus dengan konsentrasi tinggi (Suratman, 2008). Dalam pemisahan menggunakan micro capillary electrophoresis chips, waktu analisis dalam kisaran mikrodetik dan memungkinkan jumlah sampel yang sangat tinggi (Wätzig, 2003).

            Dalam analisis hemoglobin (Hb) metode HPLC memiliki keuntungan dari literatur yang luas dan ketelitian besar dalam mendeteksi sejumlah besar varian, HPLC memiliki kelemahan dari pola elusi kompleks yang mungkin sulit untuk berbagai rutinitas laboratorium kimia untuk menerapkan dalam beban kerja sehari-hari mereka. Sedangkan untuk CE polanya lebih mudah untuk dibaca dari pada pola HPLC selama HbA ada dalam sampel. Telah dicatat bahwa HbH dan Hb Bart lebih mudah dideteksi dan diukur oleh CE dibandingkan dengan metode HPLC. Salah satu fitur yang luar biasa dari metode CE adalah kemampuan untuk memperoleh pengukuran bersih HbA₂ pada pasien dengan HbE.

HPLC dan CE merupakan kombinasi yang saling melengkapi. Menggunakan HPLC sebagai metode skrining dan CE untuk mengkonfirmasi varian standar, seperti HbS, HbC, HbE, HbD, HbG, dan Hb Lepore. Kedua metode memberikan efisiensi, deteksi otomatis hemoglobin tetapi berbeda dalam logistik mengidentifikasi varian hemoglobin, terutama tidak adanya HbA dan dalam kaitannya dengan pengukuran HbA₂ saat HbS, HbC, dan adanya HbE (Keren et al, 2008).

DAFTAR PUSTAKA

1. Altria, K. D. 1996. Capillary Electrophoresis Guidebook, Principles, Operation and Applications. Humana Press. Totowa. New Jersey.
2. Keren, D. F., Hedstrom, D., Gulbranson, R., Ou, C. N., Bak, R. 2008. Comparison of Sebia Capillary Electrophoresis With the Primus High Presure Liquid Chromatography in the evaluation of Hemoglobinopathies. Am J. Clin Pathol. 130. 824-831.
3. Landers, J. P. 1997. Handbook of capillary electrophoresis. CRC press. N. Y. 2^nd ed.
4. Miksik, I., Sedlakova, P., Mikulikova, K., Eckhardt, A., Kasicka, V. 2007.  Comparison of CE-MS and LC-MS Analyses of Avian Eggshell Matrix Proteins. Chromatographia Supplement. 67.
5. Morzunova, T. G. 2006. Capillary electrophoresis in pharmaceutical analysis. Pharm. Chem. J. 4. 158-170.
6. Rajh, S.J., Kreft, S., Strukelj, B., Vrecer, F. 2003. Comparison of CE and HPLC Methods for Determining Lovastatin and Its Oxidation Products after Exposure to an Oxidative Atmosphere. Croat. Chem. Acta. 76. 263-268.
7. Serwe, M. And Ross, G.A. 2000. A Comparison of CE-MS and LC-MS for Peptide Samples. Advanstar. USA.
8. Strege, M. A., Lagu, A. L. 2004. Capillary Electrophoresis of Proteins and Peptides. Humana Press. Totowa. New Jersey.
9. Suratman, A. 2008. Strategi to Prevent Protein Adsorption and Method Development Using Coated Capillaries for Electrophoresis. Disertasi. Technischen Universität. Braunschweig.
10. Wätzig, H., Günter, S. 2003. Capillary Electrophoresis – a High Analytical Separation Technique. Clin. Chem. Lab. Med. 41, 724-738.

KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah kemampuan memisahkan molekul menggunakan karakteristik partisi dari molekul untuk tetap dalam fase diam versus fase gerak. Setelah molekul dipisahkan dari campuran, itu dapat diisolasi dan diukur. Kromatografi terbentuk apabila terdapat satu fasa diam dan satu fasa gerak. Fasa diam biasanya ialah padatan atau cairan dimana fasa gerak biasanya ialah cairan atau gas. Setiap molekul yang berbeda akan terserap kepada fasa diam dengan kekuatan yang berbeda. Pada waktu yang sama, dua molekul yang berlainan juga mempunyai kelarutan yang berbeda dalam fasa gerak.

Pemisahan Kromatografi

Komponen utama :

1.      Fase gerak:  mengalir melalui kolom dengan membawa analit.

·         Gas                  : Kromatografi Gas (GC)

·         Cair                 : Kromatografi Cair (LC), Kromatografi Lapis Tipis (TLC)

·         Supercritical fluid       : Kromatografi Supercritical Fluid (SFC)

2.      Fasa diam: tetap di tempat, tidak bergerak.

·         GC, LC ditempatkan dalam kolom

·         TLC, lapis dari sorben diatas plat.

3.      Pemisahan ini didasarkan pada partisi fase diam dan fase gerak

Terminologi Dasar Kromatografi

• Kromatograf   : Instrumen yang digunakan untuk suatu kromatografi.
• Fase diam        : Fase yang tetap ditempat didalam kolom. Dapat berupa particular padat atau gel (LC) atau berupa cairan sangat kental dibagian dalam kolom.
• Fase gerak       : Pelarut bergerak melalui kolom, baik cairan di LC atau gas di GC.

                        Eluent  : Cairan yang memasuki kolom.

                        Eluate  : cairan yang keluar dari kolom

• Elusi                : proses lewatnya fase gerak melalui kolom
• Kromatogram  : Grafik menunjukkan respons detektor sebagai fungsi dari waktu.
• Laju alir                       : berapa banyak fase gerak yang lewat/menit (mL/menit)
• Kecepatan linear: Jarak yang dilewati fase gerak per 1 menit di dalam kolom (cm / menit).

Kromatogram

Grafik menunjukkan respons detektor sebagai fungsi dari waktu elusi.

 

Waktu Retensi

Waktu yang diperlukan oleh sebuah komponen sampel untuk melintasi kolom sepanjang L disebut ‘retention time’ (t_r). Suatu pengukuran identitas

• adalah sama untuk semua senyawa.
• adalah terpanjang untuk senyawa yang tidak dipertahankan.
• adalah sama dengan waktu retensi mati.

Jenis- Jenis Kromatografi :

Liquid Liquid Chromatography (LLC)

LLC adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi antara fase gerak dan fase diam yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak.

Umumnya sebagai fase diam digunakan air dan sebagai fase gerak adalah pelarut organik. Misalnya pada kromatografi kertas, sebagai fase diam adalah air yang terserap pada serat selulosa dari kertas.

Liquid Solid Chromatography (LSC)

LSC adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika gel, alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipak dalam sebuah kolom dimana komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak. Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan yang masuk golongan ini.

Ion-exchange chromatography

Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar ion. Senyawaan yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin yang digunakan dapat dipisahkan.

Analisa asam-asam amino adalah yang umum dilakukan dengan cara ini. Contoh lain adalah asam-asam nukleat dan analisis garam-garam anorganik.

Exclusion chromatography

Dalam teknik ini, gel nonionik berpori banyak dengan ukuran yang sama digunakan untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM).

Molekul-molekul yang kecil akan memasuki pori-pori dari gel sedangkan molekul besar akan melewati sela-sela gel lebih cepat bila dibandingkan dengan molekul yang melewati pori-porinya. Jadi urutan elusi mula-mula adalah molekul yang lebih besar, molekul sedang, dan terakhir molekul yang paling kecil. Bila sebagai penyaring digunakan gel yang hidrofil (Sephadex) maka teknik ini disebut gel filtration chromatography dan bila digunakan gel yang hidrofob (polystyrene-divinylbenzene) disebut gel permeation chromatography.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat.

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair

klasik, antara lain:

• Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
• Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
• Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT
• Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
• Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.
• Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.